Ing proses nganakake studi genetik, kita kerep nemoni conto RNA sing ora cukup, contone, kanggo nyinaoni tumor oral anatomi cilik, malah sampel sel tunggal, lan conto mutasi gen spesifik sing ditranskripsi ing tingkat sing sithik banget ing sel manungsa.Mesthine, kanggo tes COVID-19, yen swab ora ana ing papan sing pas utawa ora cukup wektu nalika sampling, ukuran sampel bakal sithik banget, mula Komisi Kesehatan lan Keluarga Berencana metu rong dina kepungkur lan lulus test, lan yen sampler asam nukleat ora njupuk enem conto, sampeyan bisa laporan.
Sensitivitas reagen penting amarga kita duwe masalah iki utawa masalah kasebut, mula apa sing bisa ditindakake kanggo nambah sensitivitas RT-PCR?
Sadurunge ngrembug solusi sing bisa ditindakake, ayo sebutake rong komplikasi gedhe karo kahanan sing wis kasebut.
Kaping pisanan, kita kuwatir babagan mundhut RNA nalika kita mung duwe sawetara populasi sel ing sampel kita.Yen cara pamisahan lan reresik tradisional digunakake, kayata metode kolom utawa metode presipitasi asam nukleat, ana kemungkinan gedhe yen sawetara conto bakal ilang.Salah sawijining solusi yaiku nambahake molekul pembawa, kayata tRNA, nanging ora ana jaminan yen eksperimen pemulihan kita OK.
Dadi apa cara sing luwih apik?Pilihan sing apik kanggo sel kultur utawa sampel mikroanatomi yaiku nggunakake lisis langsung.
Ide iki kanggo pamisah sel kanggo 5 menit, ngeculake RNA menyang solusi, banjur mungkasi reaksi kanggo 2 menit, banjur nambah lysate langsung menyang reaksi transkripsi mbalikke supaya ora RNA ilang, lan pungkasanipun sijine cDNA asil langsung. menyang reaksi nyata-wektu.
Nanging apa yen, amarga saka titik wiwitan winates utawa jumlah cilik expression gen target, kita bisa daur ulang kabeh RNA lan isih ora nyedhiyani cukup Cithakan kanggo njaluk sinyal nyata-wektu apik?
Ing kasus iki, langkah pra-amplifikasi bisa migunani banget.
Ing ngisor iki minangka skema kanggo nambah sensitivitas sawise transkripsi mbalikke.Sadurunge miwiti, kita kudu takon hilir target sing kita kasengsem, supaya bisa ngrancang primer khusus kanggo target kasebut kanggo pre-amplifikasi.
Iki bisa ditindakake kanthi nggawe primer campuran nganti 100 pasang primer lan siklus reaksi 10 nganti 14 kaping.Mula, Campuran Master sing dirancang khusus kanggo syarat iki dibutuhake kanggo nggedhekake cDNA sing dipikolehi.
Alesan kanggo nyetel nomer siklus antarane 10 lan 14 iku nomer winates saka siklus njamin randomness antarane macem-macem target, kang wigati kanggo peneliti sing perlu informasi molekuler kuantitatif.
Sawise pra-amplifikasi, kita bisa njaluk jumlah gedhe saka cDNA, supaya sensitivitas deteksi ing mburi-mburi wis apik banget, lan kita malah bisa dilute sampel lan nindakake sawetara reaksi PCR nyata-wektu kanggo ngilangke kesalahan acak.
Wektu kirim: Apr-11-2023